PCR: Guía para la supervivencia (I)

En el infierno todos los días son lunes, y siempre hay que hacer PCRs.

R. García, Pensamientos Inéditos

 La PCR, mi amor más odiado.

Se trata de una de las técnicas más importantes en Biología Molecular, pero os aseguro que a veces se trata también de un auténtico dolor de cabeza.  Y es que, como todo, no es perfecta, y muchas veces falla. Bueno, no es que falle, es que son MUCHAS variables las que pueden alejarnos de ese resultado que queremos conseguir.

Así que vamos a dedicarle a esta técnica una pequeña saga. En este primer post hablaremos de qué es una PCR; en el segundo, qué tipos y variantes existen, y el tercero será verdaderamente nuestra Guía para la supervivencia, daremos una pequeña guía para el diseño de primers y otras variables a tener en cuenta.  La intención de estos posts no es sólo plasmar tres definiciones y quedarnos tan anchos; quiero que al acabar esta guía, todos podamos entender no sólo qué es la PCR, sino que entendamos un poquito más la Biología Molecular.

 

La PCR son los padres

PCR son las siglas en inglés para PORCULERA Reacción en Cadena de la Polimerasa. A todo estudiante de Biología de 2º de Bachillerato le suena este nombre, pero para seros sinceros, yo mismo tardé un par de años más en entender bien qué era la PCR. Es el problema de limitarnos a aprender definiciones de memoria, que es lo que se fomenta hoy día.

La PCR es una fotocopiadora. Pero fotocopia sólo una página del libro, la que nosotros le indiquemos. Así, si en una cadena de ADN le delimitamos el inicio y el final de lo que debe multiplicar, la copiará del tirón, en una reacción.

 

Espera, espera, espera, ¿cómo multiplicas esa zona del ADN?

Pues con enzimas, que son proteínas que permiten que millones de reacciones tengan lugar en la célula, que facilitan estas reacciones, pero no las llevan a cabo. Para que nos hagamos una idea, una enzima equivale a alguien pasándote un plato para fregarlo. No lo friega, pero te facilita las cosas. En este caso, la enzima se llama polimerasa de ADN, porque polimeriza el ADN, porque une las piezas en un todo.

 

Hablemos de PCR, Reacción en Cadena de la Polimerasa. ¿Reacción en cadena?

La polimerasa facilita esta reacción de fotocopia del ADN. Nos falta entender por qué es en cadena. Agarraos que vienen curvas.

Lo primero es entender que la molécula de ADN está formada por dos hebras que se enlazan formando esa cadena.  Cada hebra tiene una secuencia que encaja con los de la hebra contraria. Un poco como si hubiera cuatro tipos de legos de colores, y el rojo y el  amarillo sólo encajaran entre ellos y el verde y el morado sólo encajaran entre ellos. La diferencia es que aquí los legos se llaman nucleótidos o bases, y son adenina, timina, citosina y guanina -A, T, C y G-.  A sólo encaja con T y C con G. 

Para multiplicar la zona que nos interesa debemos separar las hebras. Subiremos la temperatura para romper la unión entre las cadenas (a unos 95º)Pensad que cuanto más calor, más vibra la molécula de ADN y más se rompen las uniones entre las dos hebras.

Delimitaremos la zona de inicio y de final con secuencias que las marquen, llamadas primers o cebadores (inician la reacción).  Los cebadores son trocitos muy pequeños de ADN de una sola hebra, tan pequeños que podemos sintetizarlos en un laboratorio de química, sin ayuda de enzimas. Para amplificar zona del ADN que queremos, solamente tenemos que sintetizar dos cebadores con la secuencia adecuada. Para que estos cebadores o primers se unan al ADN , si, una vez ya se han separado las hebras, bajaremos la temperatura (alrededor de 60 ºC).

La polimerasa empezará a crear la cadena a partir de los extremos que le marcan los cebadores o primers. Pero para que la polimerasa se active, tenemos que subir un poco la temperatura, esta vez hasta unos 72 ºC, que normalmente es a la temperatura que mejor realiza su función. .

Osea, subimos, bajamos y subimos. Y así hemos multiplicado por dos la secuencia de ADN que teníamos. Por mucho ADN que tuviéramos, seguimos teniendo poca cantidad, y, además, los fragmentos que hemos obtenido no son los que queríamos (a veces se une un solo primer, sin que haya otro para frenar a la polimerasa). Precisamente para obtener el resultado deseado tenemos que repetir esta reacción muchas veces, en cadena, una detrás de otra, duplicando cada vez el número de fragmentos que queremos obtener. Aunque a veces se una sólo un primer, no se notará en el resultado final. 

Si te has fijado, la reacción  se consigue mediante un ciclo de temperaturas: se sube mucho la temperatura (95 ºC), se baja (60 ºC) y se vuelve a subir un poco (72 ºC). Para hacer otra reacción, solamente hay que volver a subir la temperatura hasta 95 ºC, de forma que se separarán las hebras de las moléculas de ADN recién sintetizadas, bajar la temperatura después, etc.

Osea, subimos, bajamos y subimos, y repetimos.

La PCR, muchas variables, difícil de optimizar

Releed el apartado de arriba todas las veces que sean necesarias hasta entenderlo, porque esta parte se complica todavía más.

-Primers. Sí, delimitan la zona a multiplicar. Pero si la secuencia de estos primers está repetida en el genoma humano (cosa muy fácil, con cuatro bases que deben ocupar miles de millones de posiciones), multiplicaríamos también otras zonas. A veces no es necesario que toda la secuencia esté repetida, con que lo esté una parte, se unirán a esa zona y darán otros productos de la PCR, los productos secundarios.

-Primers. Sí, volvemos a ellos por segunders (matadme). Su secuencia está formada por una serie de bases (A, T, G y C). El problema es que G y C se unen con más fuerza que A y T, por lo que cuesta más separarlos. El número de As, Ts, Gs, y Cs determinarán la temperatura a la que se unen y separan los primers. Pero para eso hay varias fórmulas, esperad a la tercera parte.

-Iones. La polimerasa necesita iones Magnesio, entre otros, para funcionar. ¿Pero cuánto?  Pues a veces es un poco exquisita con la cantidad que necesita, y hay que ir probando una y otra vez para cada caso.

-Contaminaciones. Que Dios nos pille confesados. Se trabaja en ambientes limpios, pero aun así, el ADN a PCRear puede verse contaminado por otros ADNs. Estamos rodeados de bacterias, virus y restos de piel muerta. Hasta nosotros podemos contaminar nuestra muestra, por lo que podemos obtener muchos más productos secundarios.

-Temperatura del ambiente. Os aseguro que hay PCRs que salen en verano y no en invierno, o al revés. Y eso que la temperatura de la habitación debe estar regulada.

 -Y tantos y tantos más factores...

Con todo esto, me gustaría que seáis conscientes del tiempo que tarda en ponerse una PCR (y más tiempo todavía en confirmar su resultado), y de lo difícil que es optimizar una de estas variables. Por supuesto, dedicarse a una única PCR sin hacer nada más en el laboratorio es casi imposible, siempre hay más cosas que hacer simultáneamente. Lo más probable es que sigamos dándole vueltas en casa.

Usos de la PCR

Son infinitos. O casi. Pensad que cualquier aplicación que involucre el uso de ADN normalmente necesita que aumentes la cantidad de ADN que tienes (no puedes sacar 1000000000000000000000 de células de ningún paciente).

Ejemplos de esto: análisis forenses, de paternidad, estudios genéticos de enfermedades… Y sí, digo sólo tres porque soy así de chulo. Deal with it.

Para terminar

La PCR es una realidad, y se usa cada día en cualquier laboratorio de Biología Molecular. Pero sí es cierto que el día en que te cruzas con una PCR que dé problemas… te traerá de cabeza.

¡Pero sin ella, no podríamos investigar casi nada!

Quiero dedicar este post sin imágenes a Eduardo Ferrero, por su ardua edición; a Jesús Rodríguez, por su fastuoso acoso y, por supuesto, a todos los buenos profesores del mundo, aquellos que de verdad explican bien la PCR.

 

 PCR

 

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Rodrigo García

Vicepresidente at FEBiotec
Licenciado en Biotecnología por la Universidad de Salamanca. Ex-vicepresidente de la Federación Española de Biotecnólogos, ex-Presidente de la Asociación de Biotecnología de Salamanca, y cacereño, a ratos. Mi mayor problema es que no sé decir que no a ningún proyecto y me apunto a todo. Y aun así, todo sale siempre estupendamente. Me pregunto qué haré cuando tenga tiempo libre.

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5 pensamientos sobre “PCR: Guía para la supervivencia (I)

  1. Dr. David Gallardo

    Hola Rodrigo,

    Solamente una pequeña puntualización.

    El problema real de las PCR en cuanto a la contaminación (el ADN a PCRear puede verse contaminado por otros ADNs), no suele estar en otros ADNs genómicos que puedan contaminar (a veces sucede, pero se debe a una mala manipulación de las muestras, pipetas contaminadas, etc), sino que una vez amplificado un fragmento de ADN, hay tantas y tantas copias (millones) que si no se trabaja siguiendo unos protocolos coherentes, el producto amplificado puede contaminar una muestra aún no amplificada, viendo el resultado de otra muestra y no la que queremos analizar.

    Esa es la razón por la que en la mayoría de laboratorios de genética molecular disponemos de 3 laboratorios independientes. Un laboratorio para extraer ADN (llamado laboratorio de genómico), otro laboratorio para amplificar el ADN (laboratorio PCR) y, finalmente, otro laboratorio dónde se analizan las muestras con un equipo de electroforesis capilar (laboratorio de post-PCR). Si alguna muestra del tercer laboratorio (POST-PCR) llega al laboratorio de Genómico (primer laboratorio) y se abre un tubito ya amplificado, los millones y millones de hebras amplificadas pueden llegar a “entrar en una muestra aún no amplificada”. Como la PCR funciona por competencia, habrá más hebras de tu producto amplificado y amplificarás una vez más lo ya amplificado, no la muestra que pretendías analizar. Ese es el gran problema de las PCRs. Normalmente, cuando se trabaja en servicios rutinarios es muy difícil que nunca exista este problema y por eso es tan importante trabajar con profesionales que sigan las normas de manipulación del ADN a rajatabla, poner controles positivos de muestras con patrones ya conocidos y utilizar controles negativos dónde no se debería de amplificar nada. Evidentemente existen muchas tecnologías basadas en la PCR y no todas las PCRs llegan a Post-PCR, puesto que si se utiliza un equipo de real time, llamada PCR a tiempo real o qPCR, al mismo tiempo que se amplifica el ADN también se puede leer el resultado, utilizando sondas TaqMan, etc. Es una tecnología genial porque no necesitas abrir tubitos después de amplificar, puesto que durante la reacción el equipo ya es capaz de determinar el genotipo o la expresión de un gen o transcrito.

    Atentamente

    Dr. Gallardo

  2. Antonio

    —Mi nombre es Antonio, mi hija estudia 2 de microbilogia y necesita apuntes de problemas, te agradeceria alguna pagina o forma de conseguirlos…un saludo. gracias….

    1. Rodrigo García Autor del artículo

      Hola, Antonio,

      Pues todo depende de qué tipo de problemas, de qué asignatura, etc. ¡Cuéntame más y veré qué puedo hacer!

      Rodrigo

  3. LAURA

    Help!! es la primera vez que trabajo con PCR. estamos tratando de amplificar el DNA 16S de bacteriano de varias cepas aisladas para mandar a secuenciar para identificar en género y especie si es posible….trabajo en un laboratorio de micología y todos trabajan con hongos y sólo yo y mi compañera con bacterias, muchos hacen PCR pero nosotras las únicas que usamos DNA bacteriano y siempre nos amplifica algo en el control negativo!! hemos probado mil cosas, trabajamos lo más asépticamente posible con todo estéril (tips, eppendorfs, limpiamos las pipetas con etanol al 70% cada vez que las usamos) con guantes limpios, pelo atado, sin hablar…. y muchas veces se nos contamina el control. probamos haciendo una PCR sólo con controles negativos cambiando un reactivo de la mastermixpor vez y no nos dan resultados coherentes, lo que a veces da bien luego da contaminado y al revés tambien. evidentemente lo contaminamos durante la preparación de las reacciones antes de la pcr?? los DNTPs estarán contaminados? cómo se pueden haber contaminado? deberíamos trabajar bajo el flujo laminar en esterilidad? a nuestros compañeros que usan los mismos reactivos les da bien pero ellos amplifican genes de hongos.
    cuáles son las fuentes de contaminación con DNA bacteriano y los cuidados que debemos tener? LOS PRODUCTOS POST PCR ESTÁN EN EL MISMO LABORATORIO DONDE HACEMOS LA PCR. si no abrimos ningun tubo cómo se puede contaminar? por el aire? trabajamos sobre la mesada para hacer la mastermix y colocar los reactivos en los tubitos (usamos tubos individuales y policubetas para comparar), debería ponerme barbijo? cambiarme más seguido los guantes (siempre son nuevos)
    AGRADEZCO CUALQUIER AYUDA, YA HE HEMOS HECHO 5 VECES TODO Y SE SIGUE CONTAMINANADO :'(
    SALUDOS

  4. Maria

    Hola, buenas tardes, yo querría saber si unas PCR se contaminan más que otras, no se si influirá el tamaño de la secuencia amplificada o hay oros factores asociados.
    Un saludo.
    Gracias

    María

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